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発表・掲載日:2015/04/10

移植用細胞から腫瘍を引き起こすヒトiPS/ES細胞を除く技術を開発

-再生医療で腫瘍が発生するリスクを低減させることが可能に-

ポイント

  • ヒトiPS細胞とヒトES細胞に特異的に反応するレクチンと薬剤を融合
  • 培地に添加するだけでヒトiPS細胞とヒトES細胞を選択的に除去することが可能
  • ヒトiPS細胞とヒトES細胞を用いた再生医療の安全性向上に期待


概要

 国立研究開発法人 産業技術総合研究所【理事長 中鉢 良治】(以下「産総研」という)創薬基盤研究部門【研究部門長 織田 雅直】舘野 浩章 主任研究員、平林 淳 首席研究員、幹細胞工学研究グループ 小沼 泰子 主任研究員、伊藤 弓弦 研究グループ長は、和光純薬工業株式会社【代表取締役社長 小畠 伸三】(以下「和光純薬工業」という)試薬化成品事業部 開発第一本部 ライフサイエンス研究所と共同で、移植用細胞から腫瘍を引き起こすヒトiPS細胞やヒトES細胞(以下「ヒトiPS/ES細胞」という)を除く技術を開発した。

 ヒトiPS/ES細胞から分化させて作製した移植用細胞には、ヒトiPS/ES細胞が残存し腫瘍化する可能性があり、再生医療に応用する際の大きな障壁となっている。今回開発した技術により、移植用細胞に残存するヒトiPS/ES細胞を効率的に除去できることから、ヒトiPS/ES細胞から作製した移植用細胞を用いた再生医療の安全性向上への貢献が期待される。

 なお、この技術の詳細は、2015年4月9日(米国東部時間)に米国科学誌Stem Cell Reportsにオンライン掲載される。

移植用細胞から腫瘍を引き起こすヒトiPS/ES細胞を除く技術の概要の図
移植用細胞から腫瘍を引き起こすヒトiPS/ES細胞を除く技術の概要


開発の社会的背景

 ヒトiPS/ES細胞は無限に増殖できる能力(自己複製能)や、心筋細胞や神経細胞など、あらゆる細胞に分化する能力(多能性)を持つ。そのため、ヒトiPS/ES細胞は各種の疾病を根本的に治癒する再生医療のための細胞源として社会的にも大きな期待が寄せられている。しかし、全てのヒトiPS/ES細胞を目的の細胞に分化させることは困難であり、一定数の未分化な状態のヒトiPS/ES細胞が残存してしまう場合がある。ヒトiPS/ES細胞を患者に移植した場合には腫瘍を形成してしまう可能性があるため、移植用細胞に残存するヒトiPS/ES細胞を除去する必要がある。しかし、従来の一般的な技術では移植用細胞を前もって1つ1つの細胞に解離してからセルソーターという特殊な装置を用いてヒトiPS/ES細胞を取り除くため、細胞シートなどへの適用ができない、処理速度が遅い、移植用細胞の生存に悪影響を与える可能性がある、などの課題がある。このような課題を解決するために、移植用細胞に残存するヒトiPS/ES細胞を、安全、確実、かつ簡便に除去できる技術が求められている。

研究の経緯

 産総研は、細胞表面を高密度に覆う糖鎖を迅速、高感度に解析する技術としてレクチンマイクロアレイを開発してきた。特に近年はレクチンマイクロアレイを活用して、ヒトiPS/ES細胞表面糖鎖を網羅的に解析することにより、幹細胞の品質評価・選別技術の開発に取り組んできた(2011年6月22日 産総研主な研究成果)。その結果、レクチン(糖結合タンパク質の総称)の一種であるrBC2LCNがヒトiPS/ES細胞に特異的に結合することを見いだし、和光純薬工業との共同研究により、rBC2LCNを用いてヒトiPS/ES細胞を生きたまま染色できる試薬を開発した。また、ヒトiPS/ES細胞への結合機構を解析したところ、rBC2LCNはポドカリキシンという糖タンパク質上の特定のO型糖鎖に結合することを明らかにした(2013年3月19日 産総研プレス発表)。さらに、さまざまな種類のヒトiPS/ES細胞からポドカリキシンが培養液中にも分泌されているという現象を見いだし、これを利用して細胞培養液を用いて移植用細胞に残存するヒトiPS/ES細胞を簡便に測定する技術を開発してきた(2014年2月17日 産総研主な研究成果)。

 なお、本研究開発は、和光純薬工業からの資金提供型共同研究(平成23年度~)により産総研と和光純薬工業が共同で実施した。

研究の内容

 今回、rBC2LCNがヒトiPS/ES細胞に結合した後に、細胞内に取り込まれるという現象を見いだした。そこで細胞内に取り込まれるとタンパク質合成を阻害し細胞死を引き起こす緑膿菌由来外毒素をrBC2LCNのC末端部分に融合させた組換えタンパク質(薬剤融合型レクチン)を考案した。

 精製した薬剤融合型レクチンをヒトiPS細胞に24時間反応させた後の顕微鏡写真像を図1に示す。生きた細胞を細胞質が緑色蛍光、死んだ細胞を核が赤色蛍光で染色処理し観察すると、薬剤融合型レクチンを培養液に添加していない(0 µg/mL)場合は、多くのヒトiPS細胞は培養皿に接着し、緑色蛍光で染色されたものの、赤色蛍光ではほとんど染色されなかった。つまりほとんどのヒトiPS細胞が生きていることを示している。

 一方、10 µg/mLの薬剤融合型レクチンを培養液に添加した場合、ほとんどの細胞が培養皿への接着能力を失い、培養液中に浮遊した。わずかに接着している細胞も、死んだ細胞だけが染色される赤色蛍光で染色された。つまり、ほとんどのヒトiPS細胞が死んだことを示している。薬剤融合型レクチンはヒトES細胞でも同様の効果を示した。これらの結果から、今回開発した薬剤融合型レクチンを用いると、分化していない各種ヒトiPS/ES細胞を効率的に除去できることが分かった。

薬剤融合型レクチンのヒトiPS細胞への効果の図
図1 薬剤融合型レクチンのヒトiPS細胞への効果
位相差:実際の細胞の形態、緑色蛍光:生細胞が緑色に染色、赤色蛍光:死細胞が赤色に染色

 分化した細胞への影響を調べるため、薬剤融合型レクチン(10 µg/mL)を、レチノイン酸(RA)で分化させたヒトiPS細胞、皮膚繊維芽細胞、脂肪由来間葉系幹細胞に作用させた。その結果、ほぼ全ての細胞が緑色蛍光で染色されたものの、赤色蛍光ではほとんど染色されなかった。つまり、これら分化細胞は生きていることを示している(図2)。すなわち、薬剤融合型レクチンは、未分化なヒトiPS/ES細胞を選択的に除去し、分化した体細胞の増殖や生存には影響を与えないことが分かった。

 薬剤融合型レクチンは、細胞をあらかじめ分離するといった前処理も必要なく、細胞培養液に添加するだけで、培養している分化した細胞に影響を与えずに、未分化ヒトiPS/ES細胞だけを選択的に除去でき、大量の細胞や細胞シートなどへの適用も可能である。再生医療に用いる移植用細胞の製造や、創薬スクリーニングのための細胞調製など、さまざまな用途への応用が期待される。

薬剤融合型レクチンの分化細胞への効果の図
図2 薬剤融合型レクチンの分化細胞への効果
位相差:実際の細胞の形態、緑色蛍光:生細胞が緑色に染色、赤色蛍光:死細胞が赤色に染色

 

今後の予定

 薬剤融合型レクチンはヒトiPS/ES細胞を除去するための試薬として1年以内に実用化される予定である。また、今後は再生医療に用いるヒトiPS細胞由来の心筋細胞や神経細胞などの細胞製造への適用性を検証することにより、ヒトiPS/ES細胞から作製した移植用細胞を用いた再生医療の安全性向上に貢献していく予定である。



用語の説明

◆iPS細胞
induced pluripotent stem cell(人工多能性幹細胞)のこと。皮膚や血球など分化した細胞に数個の遺伝子を導入することで人工的に作製できる。ES細胞と同様に、自分と同じ性質を持つ細胞を無限につくることができる能力と、全ての組織に分化できる能力を持つ。[参照元へ戻る]
◆ES細胞
Embryonic stem cell(胚性幹細胞)のことで、発生初期の胚の内部細胞塊をとりだして人工的に培養したもの。自分と同じ性質を持つ細胞を無限につくることができる能力と、全ての組織に分化できる能力を持つ。[参照元へ戻る]
◆分化
生物の発生過程が進行して、単一である細胞から、さまざまな機能を持った細胞、組織、器官が形成される過程を示す。[参照元へ戻る]
◆再生医療
患者の体外で人工的に調製した細胞や組織などを、患者の体内に移植するなどの、ケガや病気で損傷した組織や臓器を再生し、失われた人体機能を回復させる医療。[参照元へ戻る]
◆未分化
特殊化する前の分化していない状態を示す。ES細胞、iPS細胞などの幹細胞は未分化な状態の細胞である。[参照元へ戻る]
◆セルソーター
溶液中に懸濁させた細胞にレーザー光を利用した励起光を照射し、それにより生じる回折光や蛍光の大きさと波長から、特定の細胞の分布を解析、分離する目的で使われる装置。[参照元へ戻る]
◆糖鎖
単糖がつながることによりできた一群の化合物を示す。糖同士だけでなく、タンパク質や脂質などとも複合体を形成し多様な分子を形成する。全ての細胞表面を高濃度に覆い、その構造は由来する生物、組織、細胞により異なることから「細胞の顔」とよばれ、細胞や疾患を判別するための指標(マーカー)として有効。細胞と細胞の情報伝達を仲介することにより、さまざまな生命現象に関与することが知られている。[参照元へ戻る]
◆レクチンマイクロアレイ
異なる糖結合特異性を持つ複数種のレクチンを同一基板(スライドグラスなど)上に固定化したもので、プロテインマイクロアレイの一種。複数種のレクチンの反応パターンから、サンプル中に存在する糖鎖を迅速、高感度にプロファイリングする技術。精製された糖鎖や糖タンパク質だけでなく、血清、細胞、組織などの生体試料の解析が可能。がん細胞や幹細胞を識別するための指標(マーカー)の探索に有効である。[参照元へ戻る]
◆幹細胞
自分と同じ性質を持つ細胞をつくることができる能力と、別の種類の細胞に分化できる能力を持つ細胞のことで、ES細胞やiPS細胞は幹細胞の一種である。[参照元へ戻る]
◆レクチン
糖鎖に結合するタンパク質の総称で、ヒトからウイルスまで全ての生物に存在する。1888年にロシアのスティルマークにより、ヒマ種子の抽出液がいろいろな動物の血球を凝集することを発見したのが最初。特定の糖鎖に結合することから、古くから糖鎖解析のための試薬として応用されるほか、細胞間の相互作用を媒介することによりさまざまな生命現象に深く関与する機能を持つ。[参照元へ戻る]
◆rBC2LCN
グラム陰性菌 Burkholderia cenocepacia由来のレクチンBC2L-CのN末端ドメインの組み換えタンパク質のこと。未分化なヒトiPS細胞やヒトES細胞と反応するものの、分化したヒト体細胞とは全く反応しないため、未分化なヒトiPS/ES細胞を検出するための検出試薬として有効。[参照元へ戻る]
◆ポドカリキシン
528のアミノ酸から構成される1型膜タンパク質の一種。細胞外ドメインはO型糖鎖、N型糖鎖、ケラタン硫酸など多数の糖鎖で修飾されており、見かけの分子量は200 kDa以上を示す巨大分子である。もともと腎臓糸球体の足細胞で見つかったタンパク質であるが、その後、ヒトiPS/ES細胞表面に多く見られることが明らかになった。[参照元へ戻る]
O型糖鎖
糖タンパク質の糖鎖のうち、タンパク質のセリンまたはスレオニン残基に結合している糖鎖のこと。これに対し、タンパク質のアスパラギン残基に結合している糖鎖をN型糖鎖という。[参照元へ戻る]
◆緑膿菌由来外毒素
細胞内に取り込まれると真核生物のペプチド鎖伸張因子eEF2をADPリボシル化することによりタンパク質合成を阻害して、細胞死を引き起こすタンパク質性の毒素。各種疾患の抗体医薬などにも応用が進んでいる。[参照元へ戻る]


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