Vol.7 No.3 2014
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研究論文:自己抗体解析のためのプロテインアレイ開発(川上ほか)−159−Synthesiology Vol.7 No.3(2014)ブアレイの高密度化またはスクリーニングの効率化が必要である。個別に発現した約20,000種類のタンパク質を使用してプロテインアレイを作製し、抗原同定を行うことは労力とコストがかかり、多数サンプルの測定および実用的使用の上で支障が生じる。そこで、10種類のタンパク質混合物を使用してアレイを作製して1次スクリーニングを行い、ヒットが含まれているタンパク質混合物のみを使って2次スクリーニングを行うことで、労力とコストを10分の1程度に減少できると考えた。10種類のタンパク質混合物の作製方法は何種類も考えられる。単純に10種類のタンパク質をそれぞれ個別に合成し、出来上がった個別のタンパク質を混合するという方法は、労力とコストがかかる。そこで、我々は10種類のタンパク質の共発現を行う上で、タンパク質合成のどの過程で10種類を一つにすることが可能なのかを検討した。上述した我々のタンパク質合成システム(図3)において、各反応過程のEntry clones、LR反応産物、PCR産物、mRNAをそれぞれ10種類混合して、タンパク質合成を行った。得られた発現タンパク質をSDS-PAGE法で分離して、Western Blotting法で検出を行った。Western Blottingは、抗体にAnti-GST HRP-Linked mouse mono Ab (NACALAI)、1.0 % SKIM MILK in PBSTに5000倍希釈し、抗体反応を行いECL plus(GE Healthcare)により5分間反応させてFluor-S MAX(BIO-RAD)で化学発光検出を行った。その結果、10種類のタンパク質の共発現は、PCR産物の以降の混合で、10種類のタンパク質すべてが効率よく発現した。コストや操作の煩雑さを考慮すると、最上流のPCR産物で10種類の混合物を作製して、タンパク質合成を行う方法がよいと結論した(図5)。混合したPCR産物をもとに合成した10種類の共発現タンパク質を使用して作製したプロテインアクティブアレイを用いて、抗原が決定されている抗体の抗原抗体反応の検討を行った。その結果、10種類の共発現系タンパク質を用いて作製したプロテインアクティブアレイによって、抗原同定を行うことができた。これにより、10種類の共発現タンパク質による1次スクリーニング(Comprehensive-PAA:C-PAA)、C-PAAで得られた10種類のタンパク質を個別展開させて抗原同定を行う2次スクリーニング(Expanded-PAA:E-PAA)の2ステップのスクリーニング方法を採用した。そして、この2ステップのスクリーニング方法により、スクリーニングの簡略化を図った(図6)。このアレイ化技術を利用して、我々は、機能別カテゴリーに分別した約20,000種類のタンパク質を搭載しているプロテインアクティブアレイを作製した。そして、このプロテインアクティブアレイの作製技術は、株式会社セルフリーサイエンスに技術移転し、プロテインアクティブアレイの製品化を目指している。3.5 卵巣がん由来傍腫瘍性小脳変性症患者由来血清中の自己抗体解析プロテインアクティブアレイを用いて、傍腫瘍性小脳変性症患者の血液中の自己抗体解析を行った。本患者は、東京大学附属病院神経内科に手のしびれを初期症状として来院した。患者血清はPBS-Tで1,000倍希釈した溶液を使用し、HRPラベルされたAnti-Human IgG Antibodyを使用して化学発光検出により自己抗体の検出を行った。検出1種発現ヒト抗原タンパク質シングルクローンの同定プロテイン・アクティブアレイヒト構成タンパク質の縮図10種共発現ヒト抗原タンパク質PCR products Mixture mRNA products Mixture LR products Mixture Entry clones Mixture kDa) Magic M Proteins Mixture Venus-MGA Magic M 203040506080100120(kDa)109876543211/10 Magic M1/10 Magic MVenus-MGAmRNA products MixturePCR products MixtureLR products MixtureEntry clones MixtureProteins Mixture図5 タンパク質共発現の比較図6 C-PAA、E-PAAによる抗原同定10987654321ORFLen(bp)FLJ No5SG(STOP)IDSample no.PCRproduct(bp)MW(kDa)Native型Entryを入れた場合発現1842163813741176966858762720624378456943654101390336933585348934473351310566.961.453.043.337.033.328.226.923.514.796.791.282.873.166.763.058.056.753.244.4TEST0002TEST0010TEST0005TEST0008TEST0007TEST0009TEST0012TEST0011TEST0001TEST0003FLJ20768FLJ37986FLJ16264FLJ34434FLJ34101FLJ34456FLJ20819FLJ21903test clone No.8自己リン酸化転写因子phosphatasekinaseUbiquitinVenus-MGAEGFPtest clone No.5test clone No.56

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