Vol.5 No.3 2012
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研究論文:糖鎖研究のための基盤ツール開発およびその応用と実用化(成松)−198−Synthesiology Vol.5 No.3(2012)③その選択されたレクチンを用いて、LC/MS/IGOT法により網羅的に癌マーカー候補の糖タンパク質を同定する。この時点で数百以上におよぶ候補分子が同定される。④血清中のマーカーを検出するには、もともと血清中に分泌量の多い糖タンパク質が有利である。バイオインフォーマティクスを用いて、(i)各種の候補糖タンパク質の血清量を推定し、量の多いものを選ぶ。(ii)目的の組織から分泌されているかどうか。目的の組織以外からも多量に分泌されている場合は、血清中で薄まってしまうので避ける。(iii)N-グリカン、O-グリカンの結合サイトが多いかどうか、多いものほどプローブとの結合力が高まるから、多いものから選ぶ。これらのパラメーターから候補分子に優先順位を付ける。⑤優先順位にしたがって市販の抗体を購入し、候補分子である糖タンパク質のウエスタン解析を行い、血清中の量を推測する。⑥この時点で有力な候補を選び出し、免疫沈降により粗精製する。粗精製した分子をもう一度、レクチンマイクロアレイにより解析し、癌患者と対象者との間でレクチンプロファイルの最も異なるレクチンAを選び出す。⑦市販の抗体は結合力が弱いものが多いので、その場合は、目的の糖タンパク質のタンパク部分に対して、自ら抗体を作製し直す。⑧強い結合力と特異性をもつ抗体の作製の後、抗体と糖鎖に対するプローブ(例えばレクチンA)のサンドイッチ・キットを開発し、100以上のサンプルで検証をする。⑨統計解析により、既存のマーカーよりも良い成績が得られたなら、1,000以上の多数検体での評価を行う。⑩さらにMSnにより糖鎖構造の変化を検出する。患者サンプルは微量しか手に入らないことが多いので、MSnにより患者サンプルの糖鎖構造を同定することが難しい。その場合は、培養癌細胞が同じレクチン反応性を示すことを確認した後、培養細胞上清から目的の糖タンパク質を多量に生成した後、MSnにより糖鎖構造を決定する。⑪この段階で、全国の臨床医に協力を求める。多数の臨床医に測定をしてもらい、極めて客観的にデータを作製し、既存のバイオマーカーとの比較の後、連携先の企業が製造承認申請から健康保険承認へと進むことにより、最終的な実用化を目指す。これまでさまざまな疾患を対象としたが、ここでは成功例として肝線維化マーカー、胆管癌マーカーの開発について次に述べる。5.2 肝線維化マーカーの開発肝臓線維化マーカーに関して、現在、連携先企業から製造承認申請の直前まできている。B型肝炎ウイルス(HBV)とC型肝炎ウイルス(HCV)は共に、感染の後20〜30年間に、急性炎症→慢性炎症→肝硬変→肝臓癌の発症の経過をたどる。世界中で数億人にのぼる感染者がいる。日本人口の7 %(約8百万人)、中国人口の10 %(1億5千万人)が感染者である。感染後炎症により肝実質細胞が壊れ、フィブリン等の線維分子と置き換わることにより、肝臓が硬化していくことを肝線維化とよぶ。線維化の診断は針バイオプシー(生検法)により確定診断されるが、これは患者にとり大きな負担であり2、3日の入院を余儀なくされる。肝線維化(肝硬化度)の程度により、針バイオプシーによる病理診断の結果、F0 (fibrosis 0)、F1、F2、F3、F4の5段階に診断される。線維化が進行するにしたがって、肝癌の発症率は高まっていく。F3は慢性炎症の結果、線維化がかなり進んでいる状態であり、F4はさらに肝硬変にまで至っている状態である。F3までの線維化にはインターフェロンやリバビリン等の薬効が期待できるが、F4に至るとあまり効果が期待でMSnによる 糖鎖構造変化の決定 プローブ作製 抗体作製 Real-time PCR 糖鎖遺伝子発現解析 レクチンマイクロアレイ 糖鎖プロファイル比較解析 キャリアタンパク質の同定 レクチンキャプチャー IGOT-LC/MS サンドイッチELISA レクチンオーバーレイ抗体アレイ 抗体オーバーレイレクチンアレイ バリデーション Bioinformaticsによる 発現組織/発現量の検討 糖鎖プロファイル比較解析 抗体オーバーレイ レクチンマイクロアレイ 抗キャリアタンパク質 抗体による血清からの 免疫沈降 抗糖鎖抗体/ 抗キャリアタンパク質抗体 培養癌細胞 癌性糖鎖変化予測 癌組織 癌性糖鎖変化を示す 糖タンパク質の同定 バイオマーカー プローブレクチンの選定 組織特異的かつ 癌性糖鎖変化を示す 糖タンパク質を選定 mRNA タンパク癌特異的糖鎖構造 図6 疾患糖鎖バイオマーカー探索の戦略

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