Vol.4 No.4 2011

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研究論文:微生物変換による活性型ビタミンD3の効率的生産(安武ほか)−228−Synthesiology Vol.4 No.4(2011)AciB、AciCを発現させて野生型Vdhを利用した反応系を構築し(図6)、この系を用いてナイシン処理細胞のVD3水酸化体生産性を検討した。その結果、ナイシン処理細胞は同未処理細胞に比べて数倍高い水酸化効率を得られることが確認された。さらに、ナイシン処理細胞を16時間の反応を1サイクルとして繰り返し反応を行うと、1回ごとのVD3の水酸化率は最大90 %近くまで向上し(ナイシン未処理細胞では50 %未満)、また4サイクル反応後のVD3水酸化体総収量は、ナイシン未処理細胞に対し約6倍高くなることを見出した[10]。このナイシンを使用した変換反応系は、短時間でVD3を90 %変換することが可能であり、VD3水酸化体の生産効率を著しく向上させた。さらに、ナイシン処理細胞は反応液としてバッファー系を利用するので培養液での反応とは異なり夾雑物を少なくできるほか、細胞を回収し再利用できるので、溶解度の低い基質を用いて反応数を増やして生産性を上げる場合において有効な手法であると考えられる。当該技術をP. autotrophicaに反映することができれば、高活性型酵素Vdh-K1を最大限活用した生産系が可能になると考えられる。4 今後の展開と課題 この研究開発は、活性型VD3の生産を微生物変換によって効率的に行うことを目指し、とりわけ現在企業において実施されている野生型菌株による変換の問題点を克服し、効率・コストにおいてそれより優れた変換系の構築を目指して行った。この研究において構築されたナイシン処理を行ったR. erythropolis細胞による変換系は、現在実際に企業で事業化されているP. autotrophicaによる系をはるかに超えた生産効率を実現していると思われる。現在は、レドックスパートナーとP450間の電子伝達のさらなる効率化が可能であるか検討を行っている。構築した高活性型酵素は、変異導入により酵素の構造安定性が低下しているため、酵素の安定性をそのままに活性を促進させる系の構築が必要と考えられるからである。P450における電子伝達効率の向上を達成し、活性向上につなげた研究成果はすでにいくつか報告されており[13]、電子伝達部位の加工がさらなる変換性能アップにつながることは充分に期待できる。一方、ナイシン処理による細胞孔の形成とCDを組み合わせた物質変換技術は、疎水性の高い難溶性物質や、CDをキャリアとして用いることが可能な物質の変換系において広く適用が可能である。一般に、脂溶性物質の微生物変換は高効率を実現することがとても難しく、そのような用途に対して高い利用価値があるものと考えている。今後、他の微生物変換系において、ナイシンおよびCDの利用価値を評価していきたいと考えている。参考文献G. Jones, S. A. Strugnell and H. F. DeLuka: Current understanding of the molecular actions of vitamin D, Physiol. Rev., 78 (4), 1193-1231 (1998). G. D. Zhu and W. H. Okamura: Synthesis of vitamin D (calciferol), Chem. Rev., 95 (6), 1877-1952 (1995).J. Sasaki, A. Miyazaki, M. Saito, T. Adachi, K. Mizoue, K. Hanada and S. Omura: Transformation of vitamin D3 to 1α,25-dihydroxyvitamin D3 via 25-hydroxyvitamin D3 using Amycolata sp. strains, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38 (2), 152-157 (1992). K. Takeda, T. Asou, A. Matsuda, K. Kimura, K. Okamura, R. Okamoto, J. Sasaki, T. Adachi and S. Omura: Application of cyclodextrin to microbial transformation of vitamin D3 to 25-hydroxyvitamin D3 and 1α,25-dihydroxyvitamin D3, J. Ferment. Bioeng., 78 (5), 380-382 (1994). T. Nakashima and T. Tamura: A novel system for expressing recombinant proteins over a wide temperature range from 4 to 35 ℃, Biotechnol. Bioeng., 86 (2), 136-148 (2004). Y. Fujii, H. Kabumoto, K. Nishimura, T. Fujii, S. Yanai, K. Takeda, N. Tamura, A. Arisawa and T. Tamura: Purification, characterization, and directed evolution study of vitamin D3 hydroxylase from Pseudonocardia autotrophica, Biochem. Biophys. Res. Commun., 385 (2), 170-175 (2009). Y. Khatri, M. Girhard, A. Romankiewcz, M. Ringle, F. Hannemann, V. B. Urlacher, M. C. Hutter and R. Bernhardt: Regioselective hydroxylation of norisoprenoids by CYP109D1 from Sorangium cellulosum So ce56, Appl. Microbiol. Biotechnol., 88 (2), 485-495 (2010).Y. Yasutake, Y. Fujii, W.-K. Cheon, A. Arisawa and T. Tamura: Structural evidence for enhancement of sequential vitamin D3 hydroxylation activities by directed evolution of cytochrome P450 vitamin D3 hydroxylase, J. Biol. Chem., 285 (41), 31193-31201 (2010). K. Nishimura, Y. Fujii, A. Arisawa, T. Tamura and Y. Yasutake: Improvement of vitamin D hydroxylase, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2011-115078 (June 16, 2011). N. Imoto, T. Nishioka and T. Tamura: Permeabilization induced by lipid II-targeting lantibiotic nisin and its effect on the bioconversion of vitamin D3 to 25-hydroxyvitamin D3 by Rhodococcus erythropolis, Biochem. Biophys. Res. Commun., 405 (3), 393-398 (2010). W. Liu and J. N. Hansen: Some chemical and physical properties of nisin, a small protein antibiotic produced by Lactococcus lactis, Appl. Environ. Microbiol., 56 (8), 2551-2558 (1990). H. E. Hasper, B. Kruijff and E. Breukink: Assembly and stability of nisin-lipid II pores, Biochemistry 43 (36), 11567-11575 (2004). L. S. Koo, C. E. Immoos, M. S. Cohen, P. J. Farmer and P. R. Ortiz de Montellano: Enhanced electron transfer and lauric acid hydroxylation by site-directed mutagenesis of CYP119, J. Am. Chem. Soc. 124 (20), 5684-5691 (2002). [1][2][3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13]謝辞当該研究は、メルシャン株式会社医薬化学品事業部(現・日本マイクロバイオファーマ株式会社)との共同研究により、またNEDOプロジェクト「微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」からの研究資金のサポートを受けて行われた。ここに謝意を表したい。

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