−ゲノムの翻訳領域と非翻訳領域を制御する機構の解明−
器官発生工学研究ラボ
桑原 知子
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浅島 誠
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独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 野間口 有】浅島 誠フェローと器官発生工学研究ラボ【研究ラボ長 浅島 誠】桑原知子研究員らは、米国 ソーク研究所 Fred H. Gage 教授らと共同で、「成体の神経新生」が起きる仕組みを解明し、中心となる遺伝子とその活性化の道筋をつきとめました。さらに、タンパク質の遺伝情報を保持している翻訳領域の遺伝子だけではなく、ゲノムの大半を占める非翻訳領域にも重要な役割がある可能性を明らかにしました。
成人では脳内の神経細胞は再生しないと考えられていましたが、成人脳内の海馬という部分には神経幹細胞が存在し、神経幹細胞から制御されながら新しい神経細胞がたえず作られています。成体においてそれを制御するメカニズムはこれまで不明でしたが、今回マウスを用いた実験によりその制御メカニズムを解明しました。
なお、本研究成果は、2009年9月号のNature Neuroscience誌（Volume 12, No.9）に掲載されました。１,2
成体の脳内の海馬には神経幹細胞が存在し、それから新しい神経が作られます（図1）。成体の海馬で生じる神経新生現象は、記憶や学習機能、また鬱病やアルツハイマー等の神経疾患とも密接な関係があります。神経疾患治療への応用や、効果的な創薬・医療の標的の探索には、『成体』での神経幹細胞から新しい神経細胞への分化制御の仕組みを解明することが重要です。
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図1： 成体の脳内、海馬に存在する成体神経幹細胞。成体神経幹細胞から新しい神経細胞が生み出される（神経新生）。
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産総研器官発生工学研究ラボでは、成体の幹細胞を解析し、再生医療・創薬開発に役立てる研究をしています。
成体の神経幹細胞は、自分自身を複製する能力と、神経細胞、アストロサイト細胞、オリゴデンドロサイト細胞の3種類の細胞に分化できる「多能性」を持っています。神経細胞にとって、アストロサイト細胞やオリゴデンドロサイト細胞などのグリア細胞は、神経細胞を支える足場でもあります。足場となる良い土がないと植物が育たないように、土は「アストロサイト細胞」、種は「神経幹細胞」、枝葉を伸ばす植物は「神経細胞」に例えることができます（図2）。「土」が「種」に与える栄養が『Wnt3a』（ウィント3a）という名のWntシグナル系タンパク質であることは分かっていましたが、その先どうやって種から芽を出すか（神経新生）という詳しい仕組みが分かっていませんでした。そこで、成体の海馬の神経幹細胞で、『Wnt3a』因子の働きを特異的に絶つと、どうなるかについて、遺伝子改変マウスやラットの実験動物、神経幹細胞の培養系で解析しました。
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図2： 神経幹細胞、神経細胞、アストロサイト細胞の共存関係。アストロサイト細胞が栄養源となる因子(Wnt3a)を産出すると、それを受け取った成体神経幹細胞から新しい神経細胞が生み出される。
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（1）Wntシグナル系タンパク質Wnt3aの役割解明
アストロサイト細胞で生産され、神経幹細胞から神経細胞への分化を促進するWntシグナル系タンパク質Wnt3aが作用すると、神経幹細胞のβカテニンが安定化されます。安定化されたβカテニンは核内に移行し、他の転写因子TCF、LEFと複合体を形成し、この複合体が神経幹細胞から神経細胞への分化を左右する制御配列を認識することを見いだしました。一方、神経幹細胞を分化させないようにするSox2という未分化維持作用をもつ転写因子があります。Sox2転写因子が認識する配列と、βカテニン・TCF・LEF複合体が認識するDNA配列を比べると、両者が共通に認識できる配列の有ることが分かりました。その配列を「Sox/LEFオーバーラップ配列」（スイッチエレメント）と定義づけました。この配列は分子認識スイッチの役割を持ち、Sox2による未分化維持のための「抑制」の指令か、Wnt3aからの神経新生のための「活性化」指令か、どちらか一方のみを、DNA下流の遺伝子に伝達します（転写開始）。
新しく発見した「Sox/LEFオーバーラップ配列」は、マウス、ラット、ヒトのNeuroDという遺伝子のプロモーター領域に共通して保存されていることをDNAデータベースにより確かめました。このNeuroD1タンパク質は神経幹細胞から神経細胞への分化を誘導する中心的な機能をもつ転写因子タンパク質です。
胎生期では、NeurogeninというWntとは別の遺伝子が直接NeuroD遺伝子を活性化することが分かっていましたが、成体では、Neurogenin遺伝子ではなく、Wnt3aによるWntシグナリング（タンパク質ネットワーク）系下流のβカテニンと転写因子TCF、LEFが共同してNeuroD1遺伝子を活性化することが分かりました。胎生期の神経新生では、アストロサイト細胞よりも先に神経細胞のみが初期段階に発生します。つまりWnt3aを産出する『土』が無い状態でも、「芽を伸ばしなさい」という指令が、『種』に元から内在されており、成体期の神経新生とは異なる強いメカニズムが支配しているといえます。一方、成体期の神経新生は胎生期とは違って、『種（幹細胞）』はどの運命を辿るかが未定です。アストロサイト細胞からWnt3aというシグナルを受け取ると、その下流の転写因子が、NeuroD遺伝子を活性化して神経新生を起こします。NeuroD遺伝子のプロモーターは、『種（幹細胞）』の状態では、Sox2による「抑制（まだ、眠っていなさい）」という指令が働くため、未分化状態（幹細胞の自己複製）を保ちます。
Wnt3aからのシグナルをシグナル系下流のβカテニン遺伝子から絶つと、どうなるかという、運命決定への影響を、ラットと遺伝子改変マウスの両方の成体の海馬で調べました。その結果、βカテニン遺伝子を成体の神経幹細胞で抑制すると、幹細胞は新しい神経を生み出すことがほとんどできなくなることがわかりました（90％以上の抑制：図3）。
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図3左：マウスの正常な海馬での神経新生。未分化状態の神経幹細胞から新しく産まれた細胞は、蛍光GFPタンパク質を発現するように設定している（緑；Sox2-CREGFPを発現している細胞）。新しく生まれた細胞は、神経分化に必要な遺伝子であるNeuroD1を発現している神経前駆細胞（赤；NeuroD1抗体で染色）になり、さらに成熟化した神経細胞に成長している様子を示している。NeuroD1を発現している細胞（赤；NeuroD1抗体陽性）と緑（Sox2CREGFPを発現している細胞）が重なっている細胞を白い矢印で示している（新生神経細胞）。青は細胞核のDAPI染色。 図3右：Wnt3a因子の作用するβカテニン遺伝子を発現できなくしたマウスの海馬の様子。未分化状態から生まれた細胞はあるが（緑；Sox2CREGFPを発現している細胞）、NeuroD1を発現している細胞（赤；NeuroD1抗体陽性）と緑（Sox2CREGFPを発現している細胞）がほとんど重ならない。新しい神経細胞が、ほとんど産み出されていない様子を現している。 |
一方、Wnt3aシグナルを阻害しても、神経幹細胞自体の自己複製やアストロサイト細胞などのグリア細胞への分化には影響を与えず、神経細胞への分化のみ影響を受けることが分かりました。この現象の主な原因は、Soxにより抑制されている成体神経幹細胞がNeuroDによる初期前駆細胞に変化する直前に、NeuroD遺伝子を発現できなくすることによって、アポトーシスにより死滅することをつきとめました。
（2）非翻訳領域の役割
Wnt3aシグナルからの活性化の道筋はNeuroD遺伝子だけではなく、ゲノムの大半を占める非翻訳領域にも伝わることを発見しました。タンパク質になるコーディング遺伝子は、ゲノム上に２％以下しかありません。哺乳動物の遺伝子の総数は大腸菌や酵母と比べて数倍ですが、反面、ゲノムのサイズは約200倍もの大きなものです。我々のゲノムの98％以上が非翻訳領域であり、進化の過程で哺乳類になって爆発的にゲノムに含まれる割合を増やしたものが「レトロトランスポゾン」という動く遺伝子です。この「レトロトランスポゾン」が成体の脳の神経新生段階で発現されることが最近判明していましたがが、その活性化の仕組みは全く分かっていませんでした。「レトロトランスポゾン(L1)」のDNA配列上に、「Sox/LEFオーバーラップ配列」が含まれており、また種間で保存されていることを見つけました。Wnt3aからのシグナルが活性化されると、NeuroD遺伝子だけではなく、ゲノムの大半を占める非翻訳領域にあるレトロトランスポゾンも活性化することが確かめられました（図4）。
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図4： 神経に分化し始めた神経前駆細胞（赤；NeuroD1抗体で染色した細胞）と、レトロトランスポゾンの活性化している神経細胞（緑;L1-GFP）。レトロトランスポゾンが活性化した細胞だけが、蛍光GFPタンパク質を発現するようなレンチウイルス（L1-GFP）をラット脳海馬に注入した。青は細胞の核をあらわしている（DAPI染色）。
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このことは、レトロトランスポゾン配列の近くにある遺伝子も、その影響を間接的に受けて発現量が上昇する可能性を示唆しています。つまり、ある１つのシグナルから、神経新生を誘導する機能を持つコーディング遺伝子NeuroD1が発現されるだけではなく、ゲノムの大半に渡って活性化される領域が増幅する仕組みです（図5）。脳の神経細胞で特異的にレトロトランスポゾン(L1)の発現が活性化されることが、げっ歯類とヒト3で確かめられています。レトロトランスポゾン(L1)は、RNAの逆転写反応を介して自分自身をゲノム上の別の場所に埋め込む『動く遺伝子（Jumping gene）』として知られており、我々一人一人が、脳内で多種の神経細胞（多様性）をつくり出す一因と考えられています。
そこで、バイオインフォマティクス解析で、マウス、ラット、ヒトのゲノム上でレトロトランスポゾン(L1)近傍にあり、L1上の「Sox/LEFオーバーラップ配列」によりWnt3aからのシグナルが間接的に伝達される遺伝子を探索しました。すると興味深いことに、これまでに神経新生のマーカーとなっていた遺伝子や、神経疾患に関連する遺伝子、細胞周期（セルサイクル）を調節する遺伝子、神経の突起やシナプス形成に関与する神経に特異的な遺伝子などが数多く明らかになりました。
（3）成体の神経幹細胞から神経新生の制御機構のまとめ（図5）
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図5： 成体の神経幹細胞から神経新生の制御機構のまとめ 神経幹細胞や神経細胞の足場になっているアストロサイト細胞が、神経分化を誘導するWnt3a因子を産出する。すると、成体神経幹細胞は神経分化を開始する。Wnt3a因子は、個人の状態や環境によって、その活性が変化するシグナルでもある。
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成体の神経新生は、個人の状態によっても左右される現象です。活発な運動（我々が行うランニングなどに相当する運動）を促したマウスや良い環境で育てられたマウスの脳ではWnt3aの発現が上昇することも分かっており、Wnt3aは個人の状態を伝達する因子とも考えられます。成体の脳では豊富な種類の神経細胞が生み出されるわけですが、今回の研究により、より個人の状態に密接にリンクしたシグナルからゲノムの非翻訳領域を介して、豊富な種類の神経細胞を新しく産み出す仕組みの糸口が見えてきたといえます。今後、バイオインフォマティクス解析からWnt3aの影響を受けることが明らかになった遺伝子群を標的とした再生医療や創薬開発への応用研究に取り組んでいきます。
(1) Kuwabara, T., Hsieh, J., Muotri, A., Yeo, G., Warashina, M., Lie, D.C., Moore, L., Nakashima, K., Asashima, M. & Gage, F.H. (2009) Wnt-mediated activation of NeuroD1 and retro-elements during adult neurogenesis, Nature Neuroscience 12, 1097-1105.
(2) Vanderhaeghen, P. (2009) Wnts blow on NeuroD1 to promote adult neuron production and diversity, Nature Neuroscience 12, 1079-1081.
(3) Coufal NG, Garcia-Perez JL, Peng GE, Yeo GW, Mu Y, Lovci MT, Morell M, O'Shea KS, Moran JV & Gage FH. (2009) L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature 460, 1127-1131.
◆神経新生
新しく神経が産まれること。新しい神経細胞は、神経幹細胞の分裂によって生み出される。新しく神経が産まれる時は、神経幹細胞が分裂して２つの細胞になり、一つは新しい神経幹細胞、もう一つが神経前駆細胞になる。この神経前駆細胞が生み出され、神経細胞に育っていく過程を総称して神経分化という。大人の脳で神経が新しく生み出されることはないと長い間言われてきたが、その定説をくつがえす多数の研究報告があり、詳しいメカニズムの研究が世界中で盛んに行われている。[戻る]
◆翻訳領域
生物の全DNA配列の中で、タンパク質のアミノ酸配列が書かれている領域を翻訳領域という。このDNA配列はmRNA配列に写し取られ、このmRNA配列からタンパク質が合成されることを翻訳という。[戻る]
◆ゲノム
細胞に含まれる染色体もしくは遺伝子全体を指す。遺伝情報を含むDNA全体。[戻る]
◆非翻訳領域
タンパク質に翻訳されないDNA領域で、非翻訳領域。最終的に機能する転写産物の遺伝情報のDNA領域を「翻訳領域」といい、それ以外の領域を指す。[戻る]
◆神経細胞
ニューロン。神経細胞へ入力刺激が入ってきた場合に、活動電位を発生させ、他の細胞に情報を伝達する。入力を受ける樹状突起、他の細胞に出力する軸索を備え、神経細胞間の情報伝達は、微小な間隙を持つシナプスでおこなわれる。[戻る]
◆海馬
脳の記憶や空間学習能力に関わる脳の器官。アルツハイマー病では、海馬の神経細胞が破壊されて萎縮する。鬱病の患者の脳でも、海馬の萎縮が確認される。脳のほぼ中心に存在する小さな器官で、神経幹細胞の基礎研究や再生医療に応用する研究に多く用いられている。[戻る]
◆神経幹細胞
外部からのシグナル伝達や細胞自律的な分化制御を受けて、自分自身を複製するか、神経細胞やアストロサイト細胞、オリゴデンドロサイト細胞を生み出す。成体の脳では神経細胞は増えないと考えられてきたが、局所的に源となる神経幹細胞が存在しており、神経の新生が起きることが報告されている。[戻る]
◆アストロサイト細胞
神経幹細胞からは自分自身の複製の他、３種類の細胞が生み出されるが、そのうちの一つがアストロサイト細胞。神経細胞を支える物質や幹細胞の複製にも重要な因子などを生産する細胞集団。海馬では神経幹細胞の足場となる細胞層の構造を作っている。[戻る]
◆オリゴデンドロサイト細胞
神経幹細胞から自分自身の複製の他、３種類の細胞が生み出される際、そのうちの一つオリゴデンドロサイト細胞になる。アストロサイト細胞とオリゴデンドロサイト細胞をあわせてグリア細胞と呼ばれる場合が多い。[戻る]
◆グリア細胞
神経系を構成する神経細胞以外の細胞。アストロサイト細胞、オリゴデンドロサイト細胞など。[戻る]
◆Wntシグナル
発生や細胞の制御に関連するタンパク質のネットワーク。標準的な経路では、βカテニンタンパク質を安定化し、核内に移行した後、TCF転写因子やLEF転写因子と相互作用し、（配列）特異的な遺伝子発現を促進する。[戻る]
◆転写因子
DNAの特異的な配列に対して結合してON-OFFのスイッチングをするタンパク質で、遺伝子（DNA）の遺伝情報をRNAに置き換えてmRNAを合成する反応を促進、あるいは逆に抑制する機能を持つ。遺伝情報は、まずDNAからRNAが生み出され（このmRNA合成を“転写”と呼ぶ）、その後RNAから機能を持つタンパク質がつくられる。[戻る]
◆プロモーター
転写因子が結合するDNAの特異的な配列を含んだ、転写反応に必要なゲノム上のDNA配列の領域。mRNA合成開始に必要な、DNA上の特定領域。[戻る]
◆胎生期と成体期
胎生期は妊娠期のことである。妊娠期の母親の胎内では、活発な幹細胞の分裂が生じ、様々な器官が形作られる。妊娠期間の間、胎児に起きる幹細胞からの分化制御と、大人（成体）になってから、各器官に存在する成体幹細胞からの分化制御のメカニズムは同じではないため、区別して研究されている。
成体幹細胞のうち、神経幹細胞は代表的なものであるため、大人の神経幹細胞から新しく神経が生まれることを「成体の神経新生（アダルト・ニューロジェネシス；Adult neurogenesis）」と呼び、独自の研究分野になっている。[戻る]
◆アポトーシス
細胞が死ぬ過程で、管理・調節された細胞死のこと。細胞死には２種類あり、一つがネクローシス（細胞壊死）、もう一つがアポトーシス（積極的細胞死または機能的細胞死）。[戻る]
◆レトロトランスポゾン
「動く遺伝子」の一種であり、多くの生物の組織のゲノム内に普遍的に存在する。レトロトランスポゾンはRNAに転写された後、逆転写酵素によって自分自身の遺伝情報をDNAに複写し、ゲノムDNA中に埋め込むことで転移する。レトロトランスポゾンの転移では、そのコピー数が埋め込まれたゲノム中で増加するため、宿主細胞のゲノムサイズが大幅に増大する。[戻る]
◆レンチウイルス
レンチウイルス (lentivirus) はレトロウイルス (retrovirus) 科に属するウイルスで、gag、pol、env の 3つの必須遺伝子以外にも、多くの遺伝子をゲノム内に持っている。増殖中および増殖停止中の細胞に感染する能力を持ち、遺伝子の解析に有用なレンチウイルス・ベクターとして実験に利用されている。目的遺伝子をゲノムに挿入できるが、複製能力のない組換えレンチウイルス（HIV-1由来）では、安全に高効率に導入遺伝子の発現が可能になる。[戻る]
◆バイオインフォマティクス
生命科学と情報学、情報工学、応用数学、統計学が融合した学問分野。生命情報学、生物情報学とも言われる。データベース化された遺伝子配列情報や遺伝子解析結果から、遺伝子間の相互作用を予測したりする、生命の情報システムを効率的に構築する情報学のこと。[戻る]
◆細胞周期（セルサイクル）
細胞分裂で生じた娘細胞が、DNA複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などを経て、再び母細胞となって細胞分裂し、新しい娘細胞になるまでの過程のことをいう。[戻る]
◆シナプス
神経細胞と別の神経細胞との間に形成される、神経活動に関わる接合部位の構造。この神経間の伝達部位で神経伝達物質が放出され、それが受け手の細胞を刺激することによりシグナルが伝達される。[戻る]
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